大豆（Glycine max L.）是一种高营养作物，是全球范围内重要的农作物之一。铝毒是酸性土壤中农业生产的主要限制因子，严重影响了作物产量和品质。研究铝毒和大豆的关系不仅有助于提高作物产量，同时为改善酸性土壤环境和农业生产提供新的思路，具有重要的实际应用价值‌。

吉林大学杨振明教授和尤江峰教授团队在之前的研究中筛选到大豆铝耐性和铝敏感品种JY70和JY62。同时，在生理和遗传水平上也鉴定到了几种抗铝基因，揭示了铝胁迫下大豆根系柠檬酸盐外流和细胞壁修饰的生理特征[1-3]。

蛋白质作为生命活动的承担者，蛋白质组学和修饰组学研究在基因及其功能的解析中发挥至关重要的作用。研究发现蛋白质磷酸化在拟南芥等植物抗铝中发挥重要作用。探究植物根系在铝胁迫下的蛋白磷酸化修饰可为了解铝抗性基因和全面阐明铝抗性调控网络提供基础。

近日，吉林大学杨振明和尤江峰教授团队在Journal of Hazardous Materials（IF=12.2）在线发表了题为“Comparative quantitative phosphoproteomic and parallel reaction monitoring analysis of soybean roots under aluminum stress identify candidate phosphoproteins involved in aluminum resistance capacity”的研究成果。该研究利用磷酸化修饰组学技术结合PRM靶向磷酸化修饰组，阐明了参与铝抗性反应的蛋白质磷酸化事件，并揭示了铝胁迫下大豆根尖中的候选磷酸化蛋白。

该研究通过磷酸化修饰组学技术结合PRM靶向磷酸化修饰组，分析了0、4或24 h铝处理下的大豆根尖中的关键磷蛋白，结果鉴定到3368个磷酸化蛋白中发现了6529个磷酸化位点，通过功能表征，最终证实了15个候选磷酸化蛋白具有明显的抗铝功能，这为蛋白磷酸化修饰参与大豆抗铝机制提供了强有力的新证据，有助于全面了解参与抗铝反应的蛋白质磷酸化修饰过程。景杰生物为该研究提供了磷酸化修饰组学分析和PRM靶向磷酸化修饰组的技术支持。

图1 本研究实验设计示意图

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磷酸化修饰组学揭示了不同铝处理时间段检测到的磷酸化蛋白

铝胁迫主要危害植物根系的生长，从而阻碍水分及养分吸收，最终影响植物生长和发育。为了揭示大豆根系铝抗性调控网络，研究团队首先对经过30 µM AlCl3处理0、4和24小时的JY70大豆根尖进行磷酸化修饰组学分析。

与对照组相比，经4小时处理（S4/S0组）的523个磷酸化蛋白中的修饰位点减少了632个，115个磷酸化蛋白中的修饰位点增加了137个。24小时处理组（S24/S0 组）在550个蛋白质中减少了668个修饰位点，在136个蛋白质中增加了164个修饰位点。以上结果表明，在4小时或24小时的铝胁迫根尖中，磷酸化程度降低的磷酸化蛋白数量显著多于修饰程度升高的。

图2 不同铝处理时间段检测到的磷酸化修饰蛋白

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磷酸化修饰蛋白的聚类分析

基于GO分析与聚类分析，研究探究了大豆根尖在铝处理24小时后的磷酸化修饰的动态变化。结果发现了六种动态模式，富集到1130个磷酸化蛋白。所有模式都与代谢过程有关，表明其在整个磷酸化蛋白质组学中占主导地位。

处理4小时后观察到的富集事件代表了早期蛋白质磷酸化反应，包括各种转运、受体介导信号通路、核苷代谢过程等，24小时的铝处理诱导了晚期蛋白质磷酸化反应，主要包括多糖代谢过程、细胞壁组织或生物发生、RNA 和蛋白质代谢调控。

图3 不同铝处理时间下富集磷酸蛋白及其通路的聚类分析

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PRM靶向磷酸化修饰蛋白的验证

考虑到差异表达磷酸化蛋白的高富集性和动态集群分布，研究分别从“植物激素信号转导”、“底物转运”、“RNA调控”和“蛋白质代谢”信号途径中筛选出26个磷酸化蛋白。这26个磷酸蛋白均再次在PRM靶向磷酸化修饰组中检测到。

为了探究这些候选蛋白抗铝胁迫的能力，研究将编码蛋白的基因过表达在大豆毛根中。铝处理4小时后发现，与野生型大豆毛根相比，过表达GmCIPK23、GmPIP2-2和GmGATA8等15个基因的大豆根尖中铝含量和胼胝质浓度降低，苏木精染色变浅，表明具有更高的铝抗性。因此，这15个基因有可能成为大豆育种过程中提高抗铝能力的关键候选基因。

图4 大豆毛根中过表达磷酸化修饰蛋白的抗铝表型分析

综上所述，研究使用磷酸化修饰组学和PRM靶向磷酸化修饰组鉴定了与铝诱导的大豆生理变化和铝抗性机制相关的铝反应性磷酸蛋白。通过大豆毛状根转化方法，观察到几个已鉴定的铝响应磷酸化蛋白，包括激素转运蛋白、转录因子、蛋白激酶和离子转运蛋白等，可能与大豆的抗铝性有关。为研究大豆中的铝抗性途径和新的铝抗性基因提供有价值的见解。

图5 磷酸蛋白修饰组和PRM靶向磷酸化修饰组确定的大豆根部与抗铝相关的磷酸化蛋白

景杰评述

本研究通过磷酸化修饰组学技术，首先聚焦于26个差异表达磷酸化蛋白，且这些蛋白均被PRM靶向磷酸化修饰组检测到，最终通过验证锁定到15个与铝诱导的大豆生理变化和铝抗性机制相关的铝响应性磷酸化蛋白。绘制出了一张描述参与不同生物过程的抗铝相关磷酸化蛋白的综合图谱。这提示修饰组学结合PRM靶向验证的创新方法，更能精准锁定候选蛋白，使得修饰研究更精确。

此外，本研究探讨了15个可响应抗铝的磷酸化修饰蛋白，而不同于植物中常见的丝/苏氨酸的磷酸化，发生在酪氨酸残基上的磷酸化修饰，也因其结构特殊、功能重要、应用广泛受到了科研工作者的广泛关注，例如：酪氨酸磷酸化可以调节植物免疫力。因此，酪氨酸磷酸化修饰蛋白如何参与调控大豆耐铝机制仍需进一步探索，植物领域的酪氨酸磷酸化调控机制也存在巨大研究空间。

值得一提的是，除经典修饰外，新型修饰近年来也常常出现在植物抗逆领域的研究中，且取得了不少进展。玉米中首次发现存在的乳酸化修饰可以调控其干旱胁迫（点击链接详细阅读：突破！首次发现玉米中存在乳酸化修饰及其干旱胁迫响应功能）；巴豆酰化修饰可正调控植物低温胁迫应答，提升抗寒性（点击链接详细阅读：PBJ重磅 | 四川农大刘庆林组首次证实：巴豆酰化修饰可正调控植物低温胁迫应答，提升抗寒性）；2-羟基异丁酰化和琥珀酰化修饰参与调控棉花幼苗应对大丽轮枝菌感染的病原体胁迫的免疫反应（点击链接详细阅读：Adv Sci | 新型酰化修饰图谱研究揭示棉花黄萎病抗性新机制）。综上，蛋白质磷酸化对于植物生长、发育和环境响应至关重要，新型酰化修饰也在研究植物抗逆过程发挥关键作用。而借助于修饰组学和PRM靶向验证的创新方法，则是推动该领域精准研究的一大利器。

来源：知乎
作者：景杰生物PTMBio